Практикум 10

Поиск консервативных массивов в выравнивании

Для выполнения заданий данного практикума был выбран домен PHL domain с идентификатором PF20474. В выравнивании seed этого домена содержится 51 последовательность, в записях UniProt белков с данным доменом 478. PHL domain участвует в связывании липидов (например, фосфоинозитидов) или белковых взаимодействиях. Некоторые PHL-домены могут работать как каркасные элементы или регуляторные модули в сигнальных путях. PH-подобные домены (включая PHL) встречаются в киназах, адапторных белках и регуляторах GTPаз.
Выравнивание было скачено и помещено в Jalview. Идентичные последовательности были удалены (их не было). В Jalview была поставлена окраска Clustal, Above identity threshold 100% порог постепенно снижался, чтобы проявились мотивы. Нашлось достаточно много одиночных консервативных колонок и проявлялись некоторые мотивы. Наиболее консервативным на вид оказался мотив ADLLA на позициях 172-176.

Рис.1. Фрагмент выравнивания, содержащий выбранный мотив ADLLA.
Далее был составлен паттерн Jalview этого мотива: [AEM]D[LI][LFV][AGS]. При поиске по данному паттерну по всему выравниванию было найдено 50 совпадений в 50 последовательностях из 51, что было очевидно. Можно сделать вывод, что паттерн составлен правильно.
Далее паттерн был переведен в формат Prosite: A-D-L-L-A
По этому мотиву был произведен поиск. В результате было найдено 1007 совпадений в 1000 последовательностях. Все совпадения получились идеальными, среди организмов есть как прокариоты, так и эукариоты. Можно сделать вывод, что результат не имеет смысла.

Поиск мотива, специфичного для одной клады филогенетического дерева

В Jalview было построено филогенетическое дерево для данного набора последовательностей.

Рис.2. Филогенетическое дерево для набора последовательностей выравнивания seed домена PHL domain.

Затем была выбрана одна клада из 10 последовательностей. Для данной клады были повторены действия из первого задания, в результате было выделено несколько мотивов. Я выбрала мотив LSKS на позициях 51-55.

Рис.3. Фрагмент выравнивания, содержащий выбранный мотив.

Данный мотив содержится в 35 последовательностях из 51, а клада состоит всего из 10 последовательностей. Получается, что это не специфичный для данной клады мотив. Мотив KTR (55-58) встречается в 28 последовательностях, мотив KVD (11-13) в 27, а мотив DGT (120-123) - в 39. Таким образом, мотив, специфичный именно для данной клады найти не удалось.

PSI-BLAST

Был случайно выбран идентификатор AC Q67XL4. Это нехарактеризованный CRM-домен-содержащий белок At3g25440, локализованный в хлоропласте Arabidopsis thaliana. CRM-домены связывают малые ядерные РНК и рибозимные РНК, регулируя их стабильность и активность участвуют в сплайсинге и процессинге РНК.

Таблица 1. Результаты поиска PSI-BLAST

Номер итерации Число находок выше порога (0,005) Идентификатор худшей находки выше порога E-value этой находки Идентификатор лучшей находки ниже порога E-value этой находки
1 18 Q9FFU1.1 0.004 Q9SL79.2 1.20E-02
2 23 P54454.1 2.00E-04 0 0
3 25 Q58068.1 2.00E-06 0 0
4 25 Q58068.1 2.00E-06 Q898C7.1 0.007

Из таблицы можно сделать вывод, что данный белок имеет близкие гомологи в SwissProt. Имеет место высокая консервативность. После первой итерации blast перестал находить белки с E-value ниже порога, после третьей перестал находить новые последовательности. Все белки, найденные в первой итерации принадлежат организму Arabidopsis thaliana, также находятся в хлоропласте и выполняют схожие функции. Последние найденные белки с E-value выше порога принадлежат бактериям и являются возможнымм РНК-связывающимм белками (функции схожие).

Поиск мотивов de novo с помощью MEME

Из базы данных Pfam были скачаны последовательности белков с выбранным ранее доменом в формате fasta, отличные от seed. Чтобы сократить список в Jalview были удалены высокосходные последовательности:

  • Последовательности белков домена PHL domain

    • Далее был произведен поиск мотивов с помощью команды:
     meme p.fasta -o results -mod anr -minw 4 -maxw 8 -nmotifs 4

    В результате было найдено 4 мотива, все с хорошим E-value, один из них содержит последовательность ADLLA, найденную для seed в задании 1.

  • Текстовая выдача meme

    • Рис.4. Мотив ADLLAAQF (ADL[LF]A[AS]QF), E-value = 8.4e-213.
    Рис.5.Мотив SLMEREGY (SLM[EV]R[ED]GY), E-value = 2.1e-186.
    Рис.6.Мотив LNVCKTRV (LNX[CK]K[TN][RK]V), E-value = 2.7e-185.
    Рис.7.Мотив SEKLVGGT (S[EK][KSR][LP][VN][GDQ]G[TSN]), E-value = 7.5e-125.

    В результате запуска fimo командой 

    fimo results/meme.txt p.fasta
    было найдено 309 значимых появлений мотивов в 63 последовательностях. При поиске мотива, содержащего последовательность найденного мотива для seed командой 
    fimo --oc fimo_seed -motif ADLLAAQF -thresh 0.001 results/meme.txt p.fasta
    было найдено 75 значимых появлений. Это 24% от всех появлений мотивов. Отсюда можно предположить, что встречаемость всех мотивов примерно равна, и что мотив из seed не является наиболее часто встречающимся.
  • Выдача fimo для всех мотивов

  • Выдача fimo для одного мотива

    • Оценка представленности сайта GATC в геноме археи Succinvibrio dextrinosolvens

  • Геном археи Succinvibrio dextrinosolvens

  • 24 варианта сайтов длины 4 полученный перестановкой букв A T G C без повторений

    • Далее запускаем команду 

    cbcalc -s sites.txt -M -o result.tsv GCF_016747875.1_ASM1674787v1_genomic.fna
    и по полученным данным строим диаграмму.

    Рис.8.Диаграмма контрастов obs/exp по методу Карлина.

    Из гистограммы явно видно, что сайт GATC представлен в наименьшем количестве у археи Succinvibrio dextrinosolvens. Интересно, что у 8 сайтов O/E примерно одинаковo, то есть ожидаемая частота совпадает с реальной. Можно предположить, что метилирование будет происходить по сайту CGAT или ATGC, так как они представлены больше ожидаемого количества.