Составление списка гомологичных белков, включающих паралоги
Были выбраны 7 полных протеомов бактерий отдела Pseudomonadota: ACICJ.fasta AROAE.fasta BRUSU.fasta BURMA.fasta PASMU.fasta POLAQ.fasta YERPE.fasta. Далее они были обьединены командой:
cat ACICJ.fasta AROAE.fasta BRUSU.fasta BURMA.fasta PASMU.fasta POLAQ.fasta YERPE.fasta > file.fasta
На основе выбранных протеомов была создана локальная база данных:
makeblastdb -in file.fasta -dbtype prot
Был проведён поиск blastp c e-value 0.0001:
blastp -task blastp -query CLPX.fasta -db file.fasta -out blast.out -evalue 0.0001
выдачаРеконструкция и визуализация
На рисунке 1 представлено дерево, отражающее верную филогению выбранных бактерий.
В топологии данного укоренённого дерева ход эволюции таксонов определяется последовательным отхождением ветвей от корня. Базальное внутреннее ребро задает разбиение множества листьев на две группы: кладу Альфа-протеобактерий {BRUSU, ACICJ} и общую ветвь остальных таксонов {YERPE, PASMU, AROAE, POLAQ, BURMA}. Далее по дереву: Класс Гамма-протеобактерий {YERPE, PASMU} отделяется от общего предка раньше и является сестринской группой по отношению к классу Бета-протеобактерий {AROAE, POLAQ, BURMA}. Внутри монофилетической группы Бета-протеобактерий таксоны {POLAQ, BURMA} являются ближайшими родственниками (сестринскими таксонами), в то время как ветвь AROAE обособляется в укоренённом поддереве раньше их разделения. Сравнение топологий отдельных белковых семейств (HslU, ClpX, FtsH) с эталонным видовым деревом выявило как консервативные элементы, так и существенные топологические перестройки, подробный анализ которых представлен ниже.
Все находки были записаны в fasta формате и выровнены. Реконструкция филогенетического дерева выполнена программой FastME на основе матрицы попарных расстояний, рассчитанных по модели LG, с использованием дистанционного метода сбалансированной минимальной эволюции (Balanced Minimum Evolution, BME)
в формате Newick
Дерево успешно разделило белки на три четкие семьи (HslU, ClpX, FtsH). Однако были найдены топологические отличия от эталонного видового дерева: 1. В семействе ClpX (синий блок) нарушен порядок ветвления внутри Betaproteobacteria: сестринскую группу образуют {CLPX AROAE, CLPX BURMA} (поддержка 90%), в то время как CLPX POLAQ отходит как внешняя группа. В видовом дереве сестринскими являются BURMA и POLAQ. 2. В семействе HslU (зеленый блок) наблюдается потеря гена — белок для бактерии POLAQ полностью отсутствует, что не позволяет восстановить полную топологию класса. При этом пара {YERPE, PASMU} стабильно кластеризуется вместе (поддержка 92%), аналогично эталону. 3. В семействе FtsH (красный блок) произошла глубокая редукция: здесь обнаружены белки только 4 видов из 7 (YERPE, BURMA, ACICJ, BRUSU). При этом один из белков YERPE (A0A5P8YB42) выделился в глубокую отдельную ветвь, что указывает на древний акт дупликации (паралогии) или ошибку сборки/аннотации.
В ходе анализа были выделены 3 группы белков (зеленый — HslU, синий — ClpX, красный — FtsH) на филогенетическом дереве были выявлены как ортологичные, так и паралогичные связи. Примерами ортологичных пар, чья топология совпадает с видовым деревом, являются ClpX у Aromatoleum aromaticum и Burkholderia mallei; HslU у Pasteurella multocida и Yersinia pestis; а также белки A5FVF9 (Acidiphilium cryptum) и A0A0H3GCZ6 (Brucella suis). Примерами паралогов (продуктов генного дублирования в рамках одного генома) могут быть ClpX и HslU у Aromatoleum aromaticum; A0A5P8YB42 и ClpX у Yersinia pestis; A0A0H2WJ72 и HslU у Burkholderia mallei
Cемейство ClpX само по себе не расщепляет белки. АТФаза находит белки, которые неправильно свернулись или больше не нужны, денатурирует и заталкивает внутрь протеазы ClpP.
Когда бактерия попадает в условия высокой температуры (например, когда у человека лихорадка при инфекции), HslU активируется, чтобы спасать клетку от дефектных белков, возникших из-за жара.
FtsH важен для выживания таких патогенов, как Yersinia pestis (чумная палочка) или Brucella. Если его «выключить», бактерия потеряет способность быстро адаптироваться к среде внутри хозяина и погибнет.